1、載玻片的處理：
抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常
進(jìn)行，可選用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等幾種
試劑，對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 APES 中，停留 20~30 秒鐘，取出
稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的 APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片
時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 Histogrip 液中，停留 1~2 分鐘，然后用雙
蒸水快速清洗三次，室溫干燥或 60oC 烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以 1:10 比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡
5 分鐘，60oC 烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為 0.05%~0.1%，消化時(shí)間為 37℃、10~40 分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的
顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為 0.4%，消化時(shí)間為 37℃、30~180 分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，
如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV 型膠原）等。
2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為 2~10m g/ml 的 saponin 溶液，消化時(shí)間為室溫孵育 30 分鐘。
3、抗原熱修復(fù)：
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。抗原熱
修復(fù)可選用各種緩沖液，如 TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以 0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）
效果。請(qǐng)選用我公司提供的 ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于 1000ml 的蒸餾水中，混勻，其 pH 值在 6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的 pH 值偏差，請(qǐng)自行調(diào)整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3％H2O2 處理 10 分鐘，蒸餾水洗 2 分鐘×
3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持 在
92℃~98℃之間并持續(xù) 10~15 分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置
條件，務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻 10~20 分鐘（注意：不可將
切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS 洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將 1500ml~3000ml 的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）
注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。
當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱 5~6 分鐘后），計(jì)時(shí) 1~2 分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至
室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS 洗 2 分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的
容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到 達(dá)
92℃~98℃起開始計(jì)時(shí) 15~20 分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻 20~30 分鐘，蒸餾水沖洗，PBS 洗，下
接免疫組化染色步驟。
4、免疫組化染色步驟：
（以美國(guó) ZYMED 公司 SP 試劑盒為例）
4.1 石蠟切片脫蠟至水。
4.2 3%H2O2 室溫孵育 5~10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
4.3 蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 分鐘，（如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。4.4 5~10％正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀
釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育 1~2 小時(shí)或 4℃過夜。
4.5 PBS 沖洗，5 分鐘×3 次。
4.6 滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS 稀釋），37℃孵育 10~30 分鐘；或滴加第二代
生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育 10~30 分鐘。
4.7 PBS 沖洗，5 分鐘×3 次。
4.8 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS 稀釋），37℃孵育 10~30 分鐘；或第二代辣根
酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育 10~30 分鐘。
4.9 PBS 沖洗，5 分鐘×3 次。
4.10 顯色劑顯色（DAB 或 AEC）。
4.11 自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。 冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片 4~8µm，室溫放置 30 分鐘后，入 4℃丙酮固定 10 分鐘，PBS 洗，5 分鐘×3。用 3％過氧化
氫孵育 5~10 分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分鐘×2。
服務(wù)內(nèi)容
（一）分析服務(wù)一
1.不同組數(shù)據(jù)表達(dá)量分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）；
2.利用生物作圖軟件做柱狀圖、三線表格、折線圖等（分辨率不低于600dpi）。通過生物統(tǒng)計(jì)軟件分析各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給出具體p值、t值或者F值等；同時(shí)標(biāo)記在相應(yīng)柱狀圖或者三線表格中。
（二）分析服務(wù)二
1.不同組數(shù)據(jù)表達(dá)量分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）；
2.利用生物作圖軟件做柱狀圖、三線表格、曲線圖等。通過生物統(tǒng)計(jì)軟件分析各組之間的統(tǒng)
計(jì)學(xué)差異；給出具體p值、t值或者F值等；同時(shí)標(biāo)記在相應(yīng)柱狀圖或者三線表格中；
3.組合Merger圖片繪制：將各組（指標(biāo)）各挑選一張典型照片，聯(lián)合柱狀圖或者折線圖，通過生物作圖軟件，繪制Merger圖片；提高圖片在文章中的反應(yīng)信息，同時(shí)降低版面占比。
三 客戶提供數(shù)據(jù)要求
1.原始數(shù)據(jù)、原始圖片（dpi≥600）及其拍照倍數(shù)（100倍、200倍或400倍）；
2.檢測(cè)樣本的分組信息，樣本若為細(xì)胞則標(biāo)注種屬和細(xì)胞名稱，樣本若為組織則標(biāo)注檢測(cè)種
屬和部位；
3.若需要做柱狀圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，請(qǐng)?zhí)峁┒啻沃貜?fù)數(shù)據(jù)；
4.若需要做柱狀圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，請(qǐng)?zhí)峁┟拷M樣本5個(gè)不同視野下的圖片或計(jì)數(shù)結(jié)果；
5.實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容及目的。
