胱天蛋白酶Caspase抑制劑 SRB-VAD-FMK(Sulforhodamine B-VAD-FMK)是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于Caspase的試劑，SRB-VAD是一種紅色熒光細(xì)胞滲透性胱天蛋白酶抑制劑，可靶向caspase 1,2,3,6,8,9或10.一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，該抑制劑與活性caspase共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光。當(dāng)添加到細(xì)胞群中時(shí)，SRB-VAD-FMK探針進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞并共價(jià)結(jié)合位于活性胱天蛋白酶異二聚體的大亞基上的反應(yīng)性半*殘基，從而抑制進(jìn)一步的酶活性。結(jié)合的標(biāo)記試劑保留在細(xì)胞內(nèi)，而任何未結(jié)合的試劑將擴(kuò)散出細(xì)胞并被洗掉。綠色熒光信號(hào)是添加試劑時(shí)細(xì)胞中存在的活性半胱天冬酶量的直接量度?？梢酝ㄟ^基于96孔板的熒光測定法，熒光顯微術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)分析含有結(jié)合的標(biāo)記試劑的細(xì)胞。該探針具有與Cy3®和TRITC類似的光譜特性，因此Cy3®和TRITC的濾光片組可以方便地與流式細(xì)胞儀或顯微鏡一起使用。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的胱天蛋白酶Caspase抑制劑 SRB-VAD-FMK(Sulforhodamine B-VAD-FMK)。
樣品操作及分析
以下方案僅提供指導(dǎo)，實(shí)際情況應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。
使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物檢測胱天蛋白酶的常規(guī)方案
1.在DMSO中準(zhǔn)備10 mM的儲(chǔ)備溶液。
2.如下準(zhǔn)備2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。
3.將等體積的半胱天冬酶標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合，并在室溫下孵育至少1小時(shí)。
4.使用熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測熒光，或使用酶標(biāo)儀監(jiān)測吸光度。
使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針檢測細(xì)胞Caspase的方案
1.在DMSO中準(zhǔn)備2-5 mM的儲(chǔ)備溶液。
2.根據(jù)需要處理細(xì)胞。
3.通過用20 mM Hepes緩沖液（HHBS）在Hanks中稀釋DMSO儲(chǔ)備溶液（來自步驟2.1），制備2X滲透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。
4.將等體積的處理過的細(xì)胞與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合（來自步驟2.3），并在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞至少1小時(shí)。
5.用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。
6.通過流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測熒光強(qiáng)度。
使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針進(jìn)行細(xì)胞半胱天冬酶測定（僅適用于＃13470-13476）
1.通過向小瓶中加入50 µL DMSO制備250X儲(chǔ)備液。
2.根據(jù)需要處理細(xì)胞。
3.以1：250的比例將250 X DMSO儲(chǔ)備溶液添加到細(xì)胞溶液中（例如2 µL至500 µL細(xì)胞），并將細(xì)胞在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
4.用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。
5.通過流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測熒光強(qiáng)度。
