吲朵青綠ICG Xtra-Osu 是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的Cy系列染料，*（ICG）是一種用于醫(yī)學(xué)診斷的花青染料。它用于確定心輸出量，肝功能和肝血流量，以及用于眼科血管造影。它具有接近800nm的峰值光譜吸收。這些紅外線能穿透視網(wǎng)膜層，使ICG血管造影成像比熒光血管造影更深的循環(huán)模式。ICG的半衰期為150至180秒，僅通過肝臟從膽汁液中排出。近期的一項研究表明ICG在注射后20分鐘內(nèi)靶向動脈粥樣硬化，并提供足夠的信號增強，用于動脈粥樣硬化兔子體內(nèi)的脂質(zhì)，發(fā)炎，冠狀動脈大小的斑塊的檢測。離體熒光反射成像顯示，與注射生理鹽水的動脈粥樣硬化兔相比，注射ICG的動脈粥樣硬化兔的斑塊靶 - 背景比高。氨基反應(yīng)性ICG衍生物用于與抗體和其他生物分子制備ICG生物綴合物。所有ICG染料都需要溶解在DMSO中。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的吲朵青綠ICG Xtra-Osu 。
樣本標(biāo)記分析
注意：該標(biāo)記方案是針對山羊抗小鼠IgG與ICG的綴合物開發(fā)的。
1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲備溶液（溶液A）：
將100L反應(yīng)緩沖液（例如，1M碳酸鈉溶液或1M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900L目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2mg / ml，）混合，得到1 mL蛋白標(biāo)記儲備液。
注意1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。 如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則需使用1M碳S氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。
注意2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注意3：牛血清白蛋白（BSA）、明膠穩(wěn)定不純的抗體等標(biāo)記的效果不理想。 疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。 可以通過透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。
注意4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率明顯降低。 為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。
2.準(zhǔn)備染料儲備溶液（溶液B）：
將無水DMSO加入到ICG染料小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。
注意：在開始綴合之前準(zhǔn)備染料儲備溶液（溶液B），現(xiàn)配現(xiàn)用，保持溶液新鮮。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲存在冰箱中兩周。 避免凍融循環(huán)。
3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：
注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能對其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。
3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中，蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。
注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。
3.2運行結(jié)合反應(yīng)（見下面的步驟4）。
3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。
3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。
3.5計算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比例（DOS）。
3.6運行上述4種綴合物的功能檢測，確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴大標(biāo)記反應(yīng)。
4.運行綴合反應(yīng)：
4.1在有效搖動下，將適量的染料儲備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。
注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。
4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物30-60分鐘。
5.純化綴合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實例。
5.1按照制造說明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。
5.2將反應(yīng)混合物（直接來自步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。
5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時，加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4將更多PBS（pH 7.2-7.4）加入所需樣品中以完成柱純化。
注意1：對于立即使用時，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。
注意2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。
