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甘油檢測試劑盒(檢測組織，細胞)
描述：甘油是甘油三酯的水解產物。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應的可靠檢測指標，但檢測更加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟，能夠檢測實體組織、細胞中的甘油含量，線性范圍為10-1200µmol/L
原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產生過氧化
氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。
適用范圍：測定實體組織、細胞中的甘油濃度。組成 (105 次微板測定或 30 次 1 ml 比色杯測定)：
(1) 裂解液 50 ml
(2) R1 試劑 16 ml
(3) R2 試劑 4 ml
(4) 4 mmol/L 甘油標準品 1 ml
4 oC，儲存 3 月。
所需設備：酶標儀、生化分析儀或 721、722 型可
見光分光光度計。佳工作波長 550nm，如無此波
長建議優(yōu)先選用 570nm、次選 530、490nm。
一 組織細胞裂解
細胞(包括分化的脂肪細胞)裂解： 消化、離心收集細胞?；蛑苯釉谂囵B(yǎng)皿內裂解。通常6孔板單孔約2x106個細胞，75cm2瓶約1x107細胞。按比例每 1~2 x 106細胞加 0.1ml 裂解液，混勻，靜置 10 分鐘。
動物組織裂解：
切記要預先將新鮮組織剪切稱重后再進行保存。組織凍存后再進行解凍、剪切、稱重可能會產生嚴重的測量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計算組織量(約 100mg)。強烈建議按比例每 1mg 組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質含量變異而產生的誤差。（注意；裂解液用量在 1ml 或更多可保證有效的裂解與脂質提?。?。用電動高速勻漿器或手動玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應根據(jù)預實驗調整初始的組織細胞加入量），而后，靜置 10 分鐘。
二. 裂解液處理：
1. 取適量上清液轉移到 1.5ml 離心管中，進行步驟
2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量或－20oC 儲存。
2. 70oC 加熱 10 分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。
3. 室溫 5000rpm 離心 5 分鐘，上層清液即可用于酶學測定。
三 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與1 ml 試劑 R2 混合即可，立即使用或 4oC 保存<1 天，變色棄去。（注意：謹防來源不明但容易發(fā)生的甘油污染，可來自操作者本人或標準品液體微粒濺射等。）
四 標準品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液*的液體，將 4 mM 甘油標準品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125µmol/L，通常取其中 4~6 管即可，注意設置 0 濃度對照反應管。
五 甘油測定
1. 參見下表加樣。待測樣品體積 10µl，多加可能會抑制反應。
2. 37oC 或 25oC 反應 10 分鐘。反應平衡后顏色在60 分鐘內穩(wěn)定。
3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調零，然后測定各管 OD 值。
4. 繪制標準曲線并計算甘油濃度。
附 Excel 作圖步驟：各標準管 OD 值為 y 軸，標準品濃度為 x 軸。(1)鼠標左鍵圈住數(shù)據(jù)，點擊做圖向導，選擇-散點圖-，點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點，點擊-添加趨勢線-，點擊-選項-，點擊-顯示公式-和-R2 值-。
5. 以每 mg 蛋白濃度或細胞數(shù)校正甘油含量。見說明書
說明：
1.血紅蛋白>2g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。
2.紅細胞糖酵解時合成磷酸甘油影響測定。
參考文獻：
1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.
2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145
甘油檢測試劑盒(檢測組織，細胞)
