高分辨率納米單顆粒分析儀 Nanocoulter Ⅰ
一種全“芯”的細(xì)胞外囊泡檢測手段
胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles, MVs)和外泌體(Exosomes, Exs)組成,微囊泡是細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜脫落的小囊泡,直徑約為100nm – 1000nm。外泌體(exosome)是一種由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性小囊泡,直徑約為40-100nm(有說30-150nm,目前尚無定論),廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中,攜帶有細(xì)胞來源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA等,參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡水平的升高,它們很有可能成為這類疾病的診斷標(biāo)志物。
相比外泌體研究遍地開花的火熱程度(僅國內(nèi)6月份就有217篇相關(guān)論文),外泌體純化和提取方法可謂是差強(qiáng)人意。目前主流的方法有超速離心(UC)、密度梯度離心(DGC)、免疫捕獲、聚合物沉淀(Precip)、超濾(UF)、排阻色譜(SEC),以及微流控分析芯片等。往往一種提取方法無法得到足夠純度、濃度的外泌體,每種方法的適用樣品種類也不一樣。
圖1 細(xì)胞外囊泡的形成過程
國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)(ISEV)在2014年提議,對于分離獲得的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定:
(1)Western Blot(WB)鑒定外泌體表面標(biāo)志物;
(2)透射電鏡(TEM)鑒定外泌體形態(tài);
(3)粒徑分析鑒定外泌體大小。免疫印跡與電鏡觀察耗時(shí)長、操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴,在實(shí)際研究中難以做到每個(gè)外泌體樣本都去做WB與TEM,所以急需一種快速簡便的粒徑分析方法,來作為外泌體鑒定的 “先鋒” 。
Nanocoulter Ⅰ “芯”方式助力外泌體提取純化研究
圖2 Nanocoulter Ⅰ外觀
Nanocoulter Ⅰ 單顆粒檢測,可液體活檢、一個(gè)樣本測試僅需5-10分鐘,測試樣本可回收等特性,恰好貼合該需求,目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外囊泡(外泌體)的提取鑒定工作中。
圖3 Nanocoulter Ⅰ原理圖
圖4 Nanocoulter Ⅰ核心技術(shù)
納米庫爾特原理,測試過程是將待測外泌體分散在電解液中,隨其通過特定孔徑的納米孔芯片,外泌體通過納米孔的一瞬間會(huì)占用相同體積電解液的位置,在孔內(nèi)外兩電極間的電阻(恒電流設(shè)計(jì)的電路)會(huì)發(fā)生瞬時(shí)變化,產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號的強(qiáng)度和次數(shù)與通過納米孔的外泌體顆粒大小及數(shù)目成一定比例,直接將脈沖信號進(jìn)行轉(zhuǎn)換,即可獲得檢測樣品中外泌體的粒徑和粒子數(shù)信息。
Nanocoulter Ⅰ采用新一代電學(xué)原理,
?單顆粒檢測,顆粒粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)多維度檢測
?不受樣本吸光度、折射率影響,與樣本光學(xué)性質(zhì)無關(guān)
?與顆粒布朗運(yùn)動(dòng)無關(guān),不受樣品黏度影響
?顆粒之間無干擾,對多分散樣本有很好的測試效果
?高分辨率,可精確看到樣本團(tuán)聚、破裂、沉降等細(xì)微變化
選型表
Nanocoulter Ⅰ 性能參數(shù):
隨著研究的深入,更多的分離提取外泌體的方法被開發(fā)出來,也有多種提取方法聯(lián)用的方式,看似百花齊放,實(shí)則良莠不齊,甚至都不盡如人意。Nanocoulter Ⅰ 逐個(gè)測量外泌體粒徑,得到外泌體的真實(shí)粒徑濃度分布,可快速判斷提取方法的優(yōu)劣。
圖5 不同分離提取方法的外泌體粒徑測定
Nanocoulter Ⅰ的原理決定測得的數(shù)據(jù)為真實(shí)粒徑信息,無需經(jīng)過反演算或者推導(dǎo)得出,并且配備多種尺寸的已知粒徑和濃度的標(biāo)準(zhǔn)顆粒(60-300nm,20nm一個(gè)梯度)來作為基線數(shù)據(jù),實(shí)現(xiàn)測量數(shù)據(jù)的定量校準(zhǔn),確保粒徑、濃度數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。無論是不同粒徑的混合樣本,還是有細(xì)微差異的同粒徑樣本,均能準(zhǔn)確無誤的辨別出來。
圖6 不同廠家生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)微球的細(xì)微差異
圖7 外泌體樣本檢測信號脈沖圖
圖8 外泌體樣本測試報(bào)告
應(yīng)用領(lǐng)域:
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脂質(zhì)體、病毒與類病毒顆粒生產(chǎn)品質(zhì)把控及標(biāo)準(zhǔn)制定(mRNA疫苗 細(xì)胞治療、基因治療);
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細(xì)胞外囊泡、外泌體不同提取方法的篩選,外泌體的鑒定;
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藥物載體、蛋白質(zhì)、疫苗、人造乳糜顆粒的粒徑、濃度測定,生產(chǎn)批間差控制;
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血細(xì)胞、血小板、細(xì)菌(油田等)、免疫檢測功能顆粒等微粒的計(jì)數(shù);
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聚苯乙烯微球、磁珠顆粒等有機(jī)和無機(jī)顆粒品質(zhì)把控;
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化妝品、半導(dǎo)體、工業(yè)涂料、染料與墨水化學(xué)、機(jī)械拋光、催化劑等工業(yè)生產(chǎn)材料性能研究。
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