Ca2+—ATP酶試劑盒,微板法

Ca2+—ATP酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 Ca2+ - ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS0680W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)始終維持在一個(gè)較低水平的 Ca2+濃度，Ca2+ 濃度的維持主要由 Ca2+-ATP 酶來(lái)維持，該酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和無(wú)機(jī)磷。通過(guò) 測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)確定該酶活性高低。 二、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 三、試劑盒的組成和配制： 【注】：全程操作需無(wú)磷環(huán)境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避 免磷污染。 四、Ca2+-ATP 酶活性檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取 上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104)：提取液(mL)為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 700nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 100 提取液 100 樣本 100 試劑二 100 100 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 80mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 8mL 提取液，混勻溶解備用。 試劑二 粉體×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 15mL 提取液，混勻溶解備用。 試劑三 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 2mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 1.8mL 的 B 液， 再加23.2mL的蒸餾水，混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑本試劑盒僅供科研使用 2 37℃ 孵育 20min 試劑三 40 40 樣本 100 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測(cè) ③ 顯色反應(yīng)： 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y = 0.6402x - 0.0034，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 定義：每小時(shí)每克組織分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(△A+0.0034) 5、液體中 Ca2+-ATPase 活力計(jì)算: 定義：每小時(shí)每毫升液體分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(△A+0.0034) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.1mL ； V2---酶促反應(yīng)總體積，0.34mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1/3 小時(shí)； W---樣本鮮重，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 10mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內(nèi)用）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整 標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 上清液 50 50 試劑四 200 200 混勻，室溫靜置 3min，700nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。