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技術(shù)文章

改善RNA提取的4點(diǎn)建議

閱讀：267發(fā)布時(shí)間：2013-4-28

在分離RNA時(shí)，良好的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)很關(guān)鍵。與DNA相比，RNA更加?jì)少F，也更不穩(wěn)定。RNA含有高反應(yīng)性的羥基（C-OH）基團(tuán)，確保鏈不斷合成、分解和再次利用。分離出的RNA迅速降解，并很容易受到核糖核酸酶（RNase）的污染。RNase似乎隨處可見(jiàn)。
加利福尼亞州*（California Academy of Sciences）的Jack Dumbacher博士目前正開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組和小RNA的分離，以便鑒定宏基因組病毒序列。他的研究目標(biāo)是了解病毒與宿主的共生關(guān)系。Dumbacher博士為改善RNA提取提出了幾點(diǎn)建議。
優(yōu)化RNA的保存
研究小組常常從偏遠(yuǎn)地區(qū)采集樣本，如熱帶雨林或珊瑚礁。他們的zui大挑戰(zhàn)在于無(wú)法用液氮迅速冷凍樣本，而RNA在乙醇中逐步降解。于是，他們用拭子蘸取鳥(niǎo)的泄殖腔，并放在RNA穩(wěn)定劑或其他包含4M 硫氰酸胍（GITC）的溶液中。由于鹽的濃度，一些RNA穩(wěn)定劑可能會(huì)給RNA的分離造成困難。當(dāng)然，如果能解決冷藏問(wèn)題，保存RNA的辦法是采集后立即用液氮冷凍樣本，并保存在-80°C。
確保良好的分離
GITC溶液通常用于RNA提取中細(xì)胞和病毒顆粒的裂解，同時(shí)防止RNase的酶活。在這種情況下，研究小組必須在裂解之前進(jìn)行完整病毒的分離，以便與細(xì)胞分開(kāi)。在現(xiàn)場(chǎng)，他們用0.2 µm的過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾較小的病毒顆粒。而較大的顆粒（如完整細(xì)胞）則被留下。其他實(shí)驗(yàn)室若使用冷凍的組織樣本，則必須快速*地勻漿。無(wú)論選擇哪種方法，始終會(huì)有些基因組（gDNA）存在。具體有多少則在很大程度上取決于用戶(hù)的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)。
盡量避免RNase
在實(shí)驗(yàn)室中，避免已純化的RNA接觸到內(nèi)源和外源的RNase至關(guān)重要。在純化開(kāi)始時(shí)，外源RNase不怎么成為威脅。但在沒(méi)有了變性劑（如GITC）的保護(hù)以及RNA純化完成后，你就要避免接觸RNase。RNase抑制劑隔離殘留的RNase，適合大部分應(yīng)用，特別是那些包含內(nèi)源RNase的應(yīng)用。*的比較基因組實(shí)驗(yàn)室使用經(jīng)DEPC處理的水。DEPC通過(guò)堿基的*修飾而讓RNase失活。同時(shí)記住，及時(shí)更換手套。
提高RNA的產(chǎn)量
不同組織不同樣本的RNA產(chǎn)量會(huì)相差很大。對(duì)于Dumbacher博士而言，每個(gè)樣本的RNA量都很低。他們所獲得的RNA量取決于小鳥(niǎo)zui后一次進(jìn)食的時(shí)間，吃了什么。Dumbacher小組的下游應(yīng)用是新一代測(cè)序。他認(rèn)為，即使樣品的RNA含量很低，但在構(gòu)建文庫(kù)以及獲得zui終結(jié)果時(shí)還是會(huì)覺(jué)得不錯(cuò)。
若要提高組織樣本的RNA產(chǎn)量，避免過(guò)度勻漿或加熱。勻漿30秒，再休息30秒，可改善RNA的回收。同時(shí)，用更多的水洗脫可釋放更多RNA。無(wú)論您的實(shí)驗(yàn)室采用何種下游技術(shù)，成功的分析都取決于良好的RNA分離技術(shù)。孰能生巧，多試試一定行。


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