新類煙堿（Neonicotinoid）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
1 使用目的：
本試劑盒用于蔬菜、水果、相應(yīng)食物、水及中毒殘留物中新類煙堿（Neonicotinoid）殘
留的定量檢測。
2 實驗原理
本試劑盒采用競爭ELISA 方法，在微孔板包被有新類煙堿（Neonicotinoid）偶聯(lián)抗原，
加入新類煙堿（Neonicotinoid）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離新類煙堿（Neonicotinoid）與微孔條上
預(yù)包被的新類煙堿（Neonicotinoid）偶聯(lián)抗原互相競爭抗新類煙堿（Neonicotinoid）抗體酶
標(biāo)記物，用TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm 波長下
進行檢測，吸光值與樣品中新類煙堿（Neonicotinoid）含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品
中新類煙堿（Neonicotinoid）的含量。
3 試劑盒組成
3.1 預(yù)包被的新類煙堿（Neonicotinoid）偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1 塊（12 孔×8 條）。
3.2 新類煙堿（Neonicotinoid）標(biāo)準(zhǔn)品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9
ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。
3.3 抗新類煙堿（Neonicotinoid）抗體酶結(jié)合物：1 瓶（6ml）。
3.4 顯色液A：1 瓶（6ml）。
3.5 顯色液B：1 瓶（6ml）。
3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。
3.7 *：1 瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。
3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9 說明書一份。
4 需要而未提供的材料
4.1 設(shè)備
4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。
4.1.2粉碎機。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。
4.1.7微量移液器。
4.2 試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2 甲醇。
5 貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍
5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6 注意事項
2
6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。
6.2 不要使用過期試劑盒。
6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有新類煙堿（Neonicotinoid），使用時應(yīng)特別注意，操作時應(yīng)帶手套。
6.5 終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗結(jié)果。
6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響
實驗結(jié)果。
6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的*，否則會影響實驗結(jié)果
6.9 混合試劑時應(yīng)避免起泡。
7 工作液準(zhǔn)備
7.1 新類煙堿（Neonicotinoid）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb
7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用
7.3 *：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用
7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照
7.4 反應(yīng)終止液：已備用
8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則
會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液
8.2強力振蕩3分鐘
8.3用Whatman 濾紙過濾
8.4取25μl處理后的樣品，加入25μl*于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）
9 酶免分析步驟
9.1 實驗須知
9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時間約2小時?；販刂潦?br />溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。
9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3 請不要改變分析程序
9.1.4 請使用的微量移液器
9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作
9.1.7 為避免交叉污染，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
9.2 分析步驟
9.2.1 預(yù)*行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進行雙孔檢測
9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）
9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗新類煙堿（Neonicotinoid）抗體酶結(jié)合物
9.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。
9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）
3
9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液
體。
9.4 反應(yīng)
9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯
色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻
9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10 結(jié)果計算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）
的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
10.1.2以新類煙堿（Neonicotinoid）濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲
線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值， 可從曲線上得到對應(yīng)點的橫坐標(biāo)， 即為新類煙堿
（Neonicotinoid）濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中新類煙堿（Neonicotinoid）濃度
C（ppb）
10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋
倍數(shù)。
10.2 半定量測定
10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光
度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色
深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
11 特異性
物質(zhì) 交叉反應(yīng)
新類煙堿（Neonicotinoid） 100%
12 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測下限為0.05ppb
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
13 標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb 。
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14 分析限制
本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。
