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小鼠鉤端螺旋體IgG （Lep-IgG）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說(shuō)明書

閱讀：140發(fā)布時(shí)間：2014-3-20

　　本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于檢測(cè)小鼠血清，血漿中鉤端螺旋體IgG(Lep-IgG)水平。
　　
　　實(shí)驗(yàn)原理：
　　
　　本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中小鼠鉤端螺旋體IgG(Lep-IgG)。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中鉤端螺旋體IgG(Lep-IgG)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中小鼠鉤端螺旋體IgG(Lep-IgG)的存在與否。
　　
　　試劑盒組成：
　　
　　試劑盒組成48孔配置96孔配置保存
　　
　　說(shuō)明書1份1份
　　
　　封板膜2片（48）2片（96）
　　
　　密封袋1個(gè)1個(gè)
　　
　　酶標(biāo)包被板1×481×962-8℃保存
　　
　　陰性對(duì)照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　陽(yáng)性對(duì)照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　酶標(biāo)試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存
　　
　　樣本處理及要求：
　　
　　1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
　　
　　2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
　　
　　3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
　　
　　4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
　　
　　5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
　　
　　6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
　　
　　7.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
　　
　　操作步驟：
　　
　　編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
　　
　　加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，
　　
　　溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
　　
　　配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
　　
　　洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
　　
　　加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
　　
　　溫育：操作同3。
　　
　　洗滌：操作同5。
　　
　　顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
　　
　　終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　
　　測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
　　
　　結(jié)果判定：
　　
　　試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00;陰性對(duì)照平均值≤0.10
　　
　　臨界值（CUTOFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
　　
　　陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為人鉤端螺旋體IgG(Lep-IgG)陰性
　　
　　陽(yáng)性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為人鉤端螺旋體IgG(Lep-IgG)陽(yáng)性
　　
　　注意事項(xiàng)
　　
　　1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
　　
　　2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
　　
　　3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
　　
　　封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　
　　5．底物請(qǐng)避光保存。
　　
　　6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm
　　
　　7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。
　　
　　保存條件及有效期
　　
　　1．試劑盒保存：；2-8℃。
　　
　　2．有效期：6個(gè)月

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