【原 理】
本實(shí)驗(yàn)采用磺酸型陽(yáng)子交換樹脂（732型）分離酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和鹼性氨基酸(賴氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3條件下，因?yàn)榈陀贚ys的pI值，Lys可解離成陽(yáng)離子掛在樹脂上；高于Asp的pI值，則Asp可解離為陰離子，不能被樹脂吸附而直接流出色譜柱，在pH 12條件下，因高于Lys的pI值，Lys又解離為陰離子從樹脂上被交換下來，這樣通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達(dá)到分離的目的。
【操 作】
1、樹脂的處理
關(guān)于市售新樹脂的處理見注1，關(guān)于樹脂浮洗的方法參照講義所述，本實(shí)驗(yàn)采用處理好的樹脂。
2、裝柱：將色譜柱垂直裝好，關(guān)閉柱底出口，在柱內(nèi)注入約2cm高pH5.3的檸檬酸緩沖液。
將浮選后已轉(zhuǎn)成鈉型的樹脂置于燒杯中，加進(jìn)1～2倍體積的檸檬酸緩沖液，經(jīng)抽氣處理后，攪成懸浮狀沿柱內(nèi)壁細(xì)心地把柱灌滿，倒時(shí)不要太快，以免產(chǎn)生泡沫。待樹脂在柱底部逐漸沉積2～3cm高時(shí)，用吸管吸去柱內(nèi)上層所出現(xiàn)的清液，慢慢打開柱底出口，繼續(xù)加注樹脂懸液，直至柱體裝到8cm高度為止。
在裝柱時(shí)要避免使柱內(nèi)液體流干而使裝柱失敗，另外樹脂懸液的溫度要相對(duì)恒定（特別是對(duì)于采用高溫法）。裝好的柱體應(yīng)該沒有紋路，沒有裂痕，沒有氣泡和柱頂表面平整而均勻，這樣方可投入使用，否則要重裝。
3、平衡：柱裝好后接上預(yù)先調(diào)好的恒流泵，用檸檬酸緩沖液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH與洗脫液的pH相同為止（pH試紙檢查），這大約需要2～3倍床體積。
4、加樣與洗脫：移去柱上的液器塞，打開柱底出口，小心使柱內(nèi)液體流至柱表面時(shí)即行關(guān)閉。用加樣吸管吸取0.5ml氨基酸混合樣品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加樣時(shí)不要過快，以免沖壞樹脂表面，加樣后慢慢打開柱底閥，使液面再與樹脂面相齊時(shí)關(guān)閉，然后再用吸管吸取適量洗脫液如此清洗柱內(nèi)壁四周1～2次。洗滌后，用緩沖液在柱內(nèi)加到約2cm高的液層，然后接上恒流泵，調(diào)流速0.5ml/分即開始洗脫。
注意在調(diào)節(jié)流速時(shí)要排除流泵與柱之間連接管內(nèi)的所有氣泡，并且在調(diào)節(jié)時(shí)不要過猛，以免影響色譜行為。
5、收集：柱流出液可用自動(dòng)分離收集器或以刻度試管人工收集按每管3m*收集4管。
6、改換高pH洗脫收集：關(guān)閉恒流泵及柱底閥，將恒流泵管內(nèi)的檸檬洗脫液更換成pH12 NaOH洗脫液，然后按上面同樣方法繼續(xù)收集到第5管到10管。
7、測(cè)定：（注2）將收集的各管編號(hào)后，分別取0.5ml收集液于一潔凈的干試管中，加入1ml pH5.3檸檬酸洗脫緩沖液，0.5ml茚三酮試劑，混合后在100℃水浴上加熱25分鐘。然后水冷卻5～10分鐘，加3m160％乙醇衡稀釋，搖勻后用721型分光光度計(jì) 在570nm處比色。測(cè)定后，以光密度為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)或毫升數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。
8、再生，對(duì)于裝好的柱使用幾次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脫，再用蒸餾水洗至中性后重復(fù)使用。
注：1、對(duì)于市售的干樹脂其處理方法為：先經(jīng)水充分溶脹后，傾去上面的泥狀細(xì)粒，反復(fù)洗幾次直到水澄清為止，然后經(jīng)浮選得到顆粒大小合適的樹脂，浮選后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小時(shí)，換酸或堿時(shí)用水先將樹脂洗至中性，zui后樹脂應(yīng)處理至溶液無(wú)黃色。這時(shí)再用1mol/L NaOH使樹脂轉(zhuǎn)成鈉型（對(duì)于其它的轉(zhuǎn)型要視實(shí)驗(yàn)和樹脂的情況而定），在蒸餾水洗至中性備用。
2、氨基酸的測(cè)定一般要求在pH5左右，這樣在本實(shí)驗(yàn)中，改變pH后和洗脫液就不能直接進(jìn)行測(cè)定。所以在第7步測(cè)定時(shí)要加入1ml pH5.3的檸檬酸緩沖液。
【器 材】
①玻璃色譜柱：長(zhǎng)19cm，內(nèi)徑1.2cm，3＃砂芯。
②恒流泵（微量*）。
③Bs-160型部分收集器或以收度試管手工操作。
④721型分光光度計(jì)。
⑤刻度吸管、試管。
⑥水浴鍋。
【試 劑】
①樹脂：磺酸型陽(yáng)離子交換樹脂（732型）
②洗脫液：0.45mol/L、pH5.3檸檬酸緩沖液，取285克檸檬酸（C6O7H8·H2O）；186克97％NaOH；105ml濃鹽酸溶于水稀釋至10升。
0.01mol/L pH12NaOH緩沖液，取4克NaOH溶于10升蒸餾水。
③樣品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。
④顯色劑
三氯化鈦——茚三酮溶液：
醋酸緩沖液：水150ml，無(wú)水醋酸鈉82克，無(wú)水醋酸25ml，加水定容250ml pH5.5。
乙二醇甲醚750ml，加入茚三酮20克，三氯化鈦（TiCl315%）1.7ml，用醋酸緩沖液定容到1升。
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