引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。 DNA 合成儀有很多種 , 主要都是由 ABI/PE 公司生產(chǎn)，而 Bioneer 自行研制 的 384 并行高通量 DNA 合成儀， 可實(shí)現(xiàn) 99% 的高合成率。無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。
亞磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將 DNA 固定在固相載體上完成 DNA 鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3′ 端向 5′ 端合成的，相鄰的核苷酸通過 3′→5′ 磷酸二酯鍵連接。
*步是將預(yù)先連接在固相載體 CPG 上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其 5′- 羥基的保護(hù)基團(tuán) DMT ，獲得游離的 5′- 羥基。
第二步，合成 DNA 的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的 3′ 端被活化， 5′- 羥基仍然被 DMT 保護(hù)，與溶液中游離的 5′- 羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
第三步，帶帽 (capping) 反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù) 5′- 羥基沒有參加反應(yīng) ( 少于 2%) ，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的 5′- 羥基上的保護(hù)基團(tuán) DMT ，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察 TCA 處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連接在 CPG 上的引物被切下來，通過 OPC, PAGE 等手段純化引物，成品引物用 C18 濃縮、脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定 OD260 定量，根據(jù)定單要求分裝。
2. 引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆ 脫鹽
寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的 DNA 結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離， 2- 氰乙氧基 ?? 磷酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)，以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基（苯甲?；彤惗』┍蝗コ?，從而形成了天然的 DNA 結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎(chǔ)生物研究。
◆ BioRP / OPC 純化
如果寡核苷酸以 “ 三苯甲基 " 的形式合成，則 N- 甲基寡核苷酸包含 5’ -DMT 基團(tuán)，提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因?yàn)?DMT 基有強(qiáng)的親脂的特性，有 5’ -DMT 基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和 5’ － DMT 寡核苷酸存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含 DMT 基團(tuán)，所以，我們能夠成功的把想要的 N- 甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。
◆ HPLC
如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向誘變或定量的基因探測，那么對其純度要求較高。脫鹽或 OPC 純化的寡核苷酸可能達(dá)不到要求，則 HPLC 純化被廣泛地用于這個(gè)目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的 HPLC 通常顯示 95-98% 純化效率，對于達(dá)到 35-mer 寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的 HPLC 與陰離子交換樹脂的 HPLC 呈現(xiàn)相似的純化效率。因?yàn)?HPLC 的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度，用 HPLC 法不能有效純化長的寡核苷酸（大于 35-mer) 。
◆ PAGE
對于長的寡核苷酸的純化（ 50-100mer ），我們* PAGE 純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠 ( 電泳 ) 作為純化基質(zhì)。盡管 PAGE 顯示出高的純化效率（＞ 98% ），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在 PAGE 之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。
3. 引物的 OD 數(shù)如何定量？
答：引物合成引物 OD 數(shù)是這樣測定的：用紫外分光光度計(jì)，波長 260nm ，石英比色杯，光程為 1 厘米 ，測定溶液的光密度。測定時(shí)溶液的光密度稀釋到 0.2-1.0 之間。 DNA 干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用 1ml 水稀釋測 OD 值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的 OD 值。
4. 需要什么級別的引物？
答：引物常用的純化方式脫鹽、 BioRP / OPC 純化、 PAGE 純化、 HPLC 純化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定訂購引物的純度級別。
應(yīng)用
引物長度要求
純度級別要求
一般 PCR 擴(kuò)增
<45 base
BioRP / OPC
一般 PCR 擴(kuò)增
>45 base
PAGE
診斷 PCR 擴(kuò)增
< 40base
BioRP / OPC , PAGE
DNA 測序
20base 左右
BioRP / OPC
亞克隆，點(diǎn)突變等
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定
BioRP / OPC , PAGE ， HPLC
基因構(gòu)建（全基因合成）
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定
PAGE
反義核酸
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定
PAGE
修飾引物
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定
PAGE, HPLC
5. zui長可以合成多長的引物？
答：引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大。有的公司合成過 120base 的引物，產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過 80mer ，按照目前的引物合成效率， 80mer 的粗產(chǎn)品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過 40% ，后續(xù)處理還有丟失很多，zui后的產(chǎn)量很低。
6. 需要合成多少 OD 數(shù)？
答：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。一般 PCR 擴(kuò)增， 2 OD 引物，可以做 200-500 次 50ul 標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接， 1 OD 就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次 PCR ，但是卻要 5-10 OD 。做全基因構(gòu)建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高 OD 數(shù)。片段越長 , zui后全長得率就越低，出錯(cuò)的幾率就越大。超出需要之外的 OD 數(shù)要求，其實(shí)也是對社會資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復(fù)多次才能成功。
7. 如何檢測引物的純度？
答：實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有 7M 尿素的 16% 的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取 0.2-0.5OD 的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性 (95 ℃ ,2mins) 。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。 600V 電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后 ( 約 2-3 小時(shí) ) ，剝膠，用熒光 TLC 板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用 EB 染色或銀染方式染色。
而有的廠家提供 Maldi-TOF 質(zhì)譜 QC 質(zhì)量控制，從而保障了合成的準(zhǔn)確率 ：
Bioneer 使用多重 Maldi-TOF 質(zhì)譜儀進(jìn)行全自動(dòng)裝載及監(jiān)測。 每份樣品的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)將自動(dòng)插入到寡核苷酸的信息單中。 Bioneer 是世界上僅有的幾個(gè)對生產(chǎn)的每份核苷酸 ( 單個(gè)寡核苷酸和高通量和成 ) 都用 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀檢測進(jìn)行核苷酸 QC 檢測的廠商，而且免費(fèi)提供質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
8. 如何計(jì)算引物的濃度？
答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 一般情況下，建議將引物的濃度配制成 50pmol/ul ，加水的體積（微升）按下列方式計(jì)算： V ( 微升 )= OD 數(shù) * （乘） 33 * （乘） * （乘） 20000 / ( 除 ) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。
注意： 1 OD260= 33 ug/ml.
9. 如何計(jì)算引物的 Tm 值？
答：引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出 Tm ，與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。
長度為 25mer 以下的引物， Tm 計(jì)算公式為： Tm = 4 ℃ (G + C)+ 2 ℃ (A + T)
對于更長的寡聚核苷酸， Tm 計(jì)算公式為：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) ? 600/size
公式中， Size = 引物長度。
Tm 的定義： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
10. 引物（含修飾）的分子量是如何確定的 ？
答：非修飾的引物的 Molecular Weight 在隨引物提供的報(bào)告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計(jì)一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為 324.5 ，引物的分子量 = 堿基數(shù) x 堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接?jì)算 MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（ Nx * ） +( Ni* Wi) +16* Ns? 62.
NA, NG, NC, NT, Ni 分別為引物中堿基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的數(shù)量， WA, WC, WG, W, Wi 分別為引物中堿基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量， Nmod ， Wmod 分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。
對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如 G+A 混合的分子量為（ 313.21+329.21 ） /2 = 321.21 。 Ns 為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)位置增加分子量 16 。
常規(guī)堿基分子量：
Base
Molecular Weight
A
313.21
C
289.18
G
329.21
T
304.19
I
314.2
U
290.17
常規(guī)修飾基團(tuán)分子量
修飾基團(tuán)
分子量
修飾基團(tuán)
分子量
5’ -Biotin
405.45
3’ -TAMARA
623.60
5’ -(6 FAM)
537.46
3’ -Dabsyl
498.49
5’ -HEX
744.13
3’ -(6 FAM)
569.46
5’ -TET
675.24
3’ -Amino Modifier C3
153.07
5’ -Cy5
533.63
3’ -Amino Modifier C7
209.18
5’ -Cy3
507.59
3’ -Thiol Modifier C3
154.12
11. 如何溶解引物？
答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無菌水或 10mM Tris pH7.5 緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的 pH 值比較低（ pH4-5 ） , 引物在這種條件下不穩(wěn)定。
12. 如何保存引物？
答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以*保存。溶解后的引物 -20 度可以*保存。如果對實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的 OD 數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。
13. 合成的引物 5’ 端是否有磷酸化
答：合成的引物 5’ 為羥基，沒有磷酸基團(tuán)。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行 5′ 端磷酸化，或者要求引物合成公司合成時(shí)直接在 5′ 或 3′ 端進(jìn)行磷酸化，需要另外收費(fèi)。
14. 引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？
連接反應(yīng)需要引物的 5’ 磷酸基團(tuán)。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。 SiRNA 分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時(shí)需要提高退火溫度。
15. 測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？
答：測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是 40 個(gè)堿基以下的引物 , 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列 COPY 到合成儀的，堿基輸錯(cuò)的機(jī)會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法*解決這個(gè)問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。
引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率zui高也就是 99% ，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失 DMT, 導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽 (capping) 反應(yīng)不*造成的， Caping 反應(yīng)主要是封閉極少數(shù) 5′- 羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能 * 脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在 G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基 G 在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫嘌呤）， 2,6 diaminopurine , DNA 復(fù)制和擴(kuò)增過程中 DNA 聚合酶將 2,6 diaminopurine 看作堿基 A ，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基 G-A 置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基 G 或 A 的缺失。
引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)中。
16. 長鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？
答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到 * ，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物*，這種心情可以理解。但是猶如 PCR 擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證 * 正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶 PCR 擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。
17. 如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？
答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得，生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取克隆測序，可能會找到正確克隆的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)， 40 個(gè)堿基以下的引物，測 1-2 個(gè)克隆就可以了； 40 個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和*次的引物一樣，都可能含突變，不會因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測幾個(gè)，否則就重合一下引物。
18. 引物是經(jīng)過 PAGE 純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
答：理論上分析型 PAGE 變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。但是制備 PAGE 電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。國內(nèi)有一個(gè)不好的現(xiàn)象， PAGE 純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少 OD 數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。
19. TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？
答：下列原則供您參考。
◆ TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物 50-150bp ），但不能與引物重疊。
◆ 長度一般為 18-40mer 。
◆ G-C 含量控制在 40-80% 左右。
◆ 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免 GGGG 或更多 G 出現(xiàn)。
◆ 在引物的 5’ 端避免使用 G 。
◆ 選用比較多的堿基 C 。
◆ 退火溫度 Tm 控制在 68-70C 左右。
有用的熒光染料參數(shù)
Name
吸收波長
發(fā)射波長
colors
6-FAM （ 6-carboxy-fluorescein ）
494nm
518nm
Green
TET （ 5-tetrachloro-fluorescein ）
521nm
538nm
Orange
HEX （ 5-hexachloro-fluorescein ）
535nm
553nm
Pink
TAMRA （ tetramethyl-6-carboxyrhodamine ）
560nm
582nm
Rose
ROX （ 6-carboxy-x-rhodamine ）
587nm
607nm
Red
Cy3 （ Indodicarbocyanine ）
552nm
570nm
Red
Cy5 （ Indodicarbocyanine ）
643nm
667nm
Violet
20.Primer 設(shè)計(jì)的基本原則是什么？
答：引物設(shè)計(jì)的下列原則供您參考。
◆ 引物長度一般在 18-35mer 。
◆ G-C 含量控制在 40-60% 左右。
◆ 避免近 3’ 端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
◆ 如果可能避免在 3’ 端zui后 5 個(gè)堿基有 2 個(gè)以上的 G 或 C 。
◆ 如果可能避免在 3’ 端zui后 1 個(gè)堿基為 A 。
◆ 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免 GGGG 或更多 G 出現(xiàn)。
◆ 退火溫度 Tm 控制在 58-60C 左右。
◆ 如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。
21. 為什么引物的 OD260/OD280 小于 1.5 ？
答：引物應(yīng)該全是 DNA ，但是 OD260/OD280 的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？引物化學(xué)合成，哪里有機(jī)會污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是 OD260/OD280 的比值不能用來衡量引物的純度。 OD260/OD280 的比值過低一般是由于引物中 C/T 的含量比較高所致。下表是一個(gè) 20mer 同聚體引物的 OD260/OD280 的比值，清楚表明 OD260/OD280 的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition
A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3
2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3
1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3
1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3
1.66
22. 同樣的 OD 用 PAGE 檢測， EB 染色為什么深淺不一？
答：通?？梢杂?EB 染色的方法來判斷雙鏈 DNA 的量 ( 如質(zhì)粒 DNA) ，因?yàn)?EB 可以嵌合到雙鏈 DNA 中。而合成的單鏈 DNA ，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同， EB 的染色程度也會有差異，比如 Oligo(dT) 等不形成二級結(jié)構(gòu)， EB 染色效果就非常差。所以不要用 EB 染色的方法來定量，而用紫外分光光度計(jì)檢測。同樣道理，用 EB 染色來照片不適合所有引物。
23. 引物不純會有什么后果？
答：引物不純可能會導(dǎo)致： 1) 非特異性擴(kuò)增； 2) 無法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物 5′ 端酶切位點(diǎn)的酶切開，特別是沒有保護(hù)堿基的引物； 3) 用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。
24. 已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時(shí)間再使用就不好 了？
答：如果溶解引物的水 PH 過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時(shí)沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍溶。建議使用 10mM Tris pH7.5 緩沖液溶解引物，因?yàn)橛行┱麴s水的 pH 值比較低（ pH4-5 ） , 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是 PCR 使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不*一致。
25.PCR 擴(kuò)增不出就引物有問題嗎？
答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的 PCR 擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決 PCR 擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出、擴(kuò)增效率低的問題。如巢式 PCR 就是擴(kuò)增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴(kuò)增 , GC 含量高的片段，非要采用特殊擴(kuò)增手段才能擴(kuò)增出了。
引物擴(kuò)增不出，主要是下列兩種情況比較常見（ 1 ） RT-PCR 。請注意，很多基因通過常規(guī) RT ?PCR 方法是很難擴(kuò)增出來的。 RT- PCR 成功的關(guān)鍵在于 RT 的反應(yīng)的 RNA 質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中含量。（ 2 ）從基因組中擴(kuò)增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量?；蚪M DNA 過高，會影響反應(yīng)體系中的 Mg 和 pH 。
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