MTT檢測試劑盒細(xì)胞凋亡與增殖

商品屬性：

商品介紹：

MTT廣泛用于檢測細(xì)胞生長，其原理是MTT可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結(jié)晶，而死細(xì)胞則無此活性。深紫色的formazan結(jié)晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。

產(chǎn)品特點：

1．采用的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。

2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復(fù)性好。

3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)微孔板檢測。

4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。

使用方法：

下面操作是檢測細(xì)胞毒性的試驗，其他應(yīng)用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。

㈠、接種細(xì)胞

1．按常規(guī)化法消化匯合的單層細(xì)胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。

2．200g離心5分鐘收集細(xì)胞沉淀。

3．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸浮液并計數(shù)。

4．將細(xì)胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據(jù)細(xì)胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個/mL。

5．將足夠量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細(xì)胞懸液。

6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中加入200μL細(xì)胞懸液(對正常細(xì)胞)。如果是腫瘤細(xì)胞，則加入100μL腫瘤細(xì)胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細(xì)胞加在孔的正中，否則細(xì)胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。

7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細(xì)胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對照(用于測OD時調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應(yīng)對第11 列反應(yīng)的影響。

8．按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期。

㈡、藥物處理

9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預(yù)試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。

10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動細(xì)胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。

11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細(xì)胞-藥物的對照。

12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。

13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細(xì)胞的時間，由用戶自己決定。

14．處理結(jié)束后去除第2 到第11列(共10列，均含細(xì)胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。

15．每天換培養(yǎng)使細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增2-3倍(所需時間隨細(xì)胞不同而不同)。

㈢、存活細(xì)胞計數(shù)

16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時。注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。

17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會影響光吸收，盡可能去除。

18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。

19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。

?注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對照)調(diào)零。

20．計數(shù)同樣處理的各次重復(fù)的平均值。

21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度對值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進(jìn)作用的則斜率加大。在細(xì)胞

步驟和注意事項：?

準(zhǔn)備實驗環(huán)境：?確保實驗區(qū)域清潔，?使用酒精清潔計數(shù)板和蓋玻片，?然后用吸水紙輕輕擦干。?

細(xì)胞培養(yǎng)：?

準(zhǔn)備試管或培養(yǎng)皿、?細(xì)胞培養(yǎng)基和待培養(yǎng)的細(xì)胞。?

取出保存于低溫下的細(xì)胞苗，?并加入培養(yǎng)基中，?搖晃混合均勻。?

用移液管將細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞種植在試管或培養(yǎng)皿中。?

將試管或培養(yǎng)皿放置于恒溫培養(yǎng)箱中，?定期更換培養(yǎng)液。?

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：?

細(xì)胞系的凍存是將生長較好的傳代細(xì)胞懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，?以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，?并在此溫度下對其長期保存的過程。?

復(fù)蘇則是將凍存的細(xì)胞系恢復(fù)到常溫的過程，?原則是“慢凍快融"，?以較大限度地保存細(xì)胞活力。?

細(xì)胞計數(shù)：?

制備細(xì)胞懸液，?使用消化單層培養(yǎng)細(xì)胞或收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，?制成單個細(xì)胞懸液。?

在顯微鏡下，?用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，?細(xì)胞壓中線時，?只計左側(cè)和上方者，?不計右側(cè)和下方者。?

熒光顯微鏡使用：?

使用熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，?并觀察細(xì)胞所發(fā)出的熒光信號，?以研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。?

聚合酶鏈反應(yīng)（?PCR）?：?

準(zhǔn)備PCR反應(yīng)所需的DNA模板、?引物、?聚合酶和核苷酸。?

按照PCR反應(yīng)液配制表制備反應(yīng)液。?

在反應(yīng)器中加入反應(yīng)液，?開始PCR反應(yīng)。?

PCR反應(yīng)的成功與否，?可以通過電泳、?測序等方法進(jìn)一步確認(rèn)。?

轉(zhuǎn)染：?

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染所需的載體DNA和細(xì)胞。?

制備轉(zhuǎn)染試劑，?將DNA載體溶解于轉(zhuǎn)染試劑中，?與細(xì)胞混合均勻。?

處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，?并進(jìn)行下一步實驗。?

在操作過程中，?應(yīng)注意實驗室安全規(guī)范，?避免隨意丟棄垃圾，?及時登記購買耗材或試劑，?保持實驗環(huán)境的清潔和安全

下列是公司正在出售的產(chǎn)品：