AGL1 Electrocompetent cell 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

AGL1菌株；農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素； EHA101；LBA4404；GV3101；植物轉(zhuǎn)基因研究；

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產(chǎn)品描述：

AGL1菌株的染色體背景為C58，RecA，核基因含利fu平抗性基因rif和羧芐青mei素抗性基因carb，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pTiBo542DT-DNA，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pTiBo542DT-DNA質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能雖被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。AGL1菌株適用于擬南芥、水稻、楊樹等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

我司懋康生物提供的AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，特別適合大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。基因型C58 RecA (rif^R/carb^R) Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine，經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁵ cfu/μg DNA。

產(chǎn)品組分：

注意事項(xiàng)

1）   感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融和放置時(shí)間過長(zhǎng)，以免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2）   整個(gè)轉(zhuǎn)化操作，嚴(yán)格根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件要求進(jìn)行。

3）   加入質(zhì)粒的體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率急劇下降。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4）   為確保zui高轉(zhuǎn)化效率，整個(gè)操作過程應(yīng)盡量輕柔，并保持低溫。

5）   轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少zui終涂板用量。

6）   平板上克隆密度過大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小。為獲得大菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

7）   利fu平濃度應(yīng)≤25μg/ml，過高濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。我司EHA101感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含50μg/ml卡那mei素，若所用平板含20μg/ml 利fu平，則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

8）   培養(yǎng)基中加入利fu平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但這些篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些篩選抗生素，因Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（基本可以忽略）。

9）   為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1)        將0.1 cm店擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min，待其瀝干水分，正置5min，使乙醇充分揮發(fā)干凈，立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5min使其充分降溫。

2)        取-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞于室溫或手心片刻待其部分融化，達(dá)到冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰浴中使其*融化。

3)        往50μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入0.01~1μg（體積不大于6μl）質(zhì)粒DNA，用手管底使其混勻，立即插入冰中。用槍輕輕吹打混勻感受態(tài)細(xì)胞-質(zhì)粒之后快速轉(zhuǎn)移到店擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用【注意：由于感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高，*次使用做預(yù)試驗(yàn)確定zui加的質(zhì)粒用量】。

4)        啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)參考Bio-rad，具體使用請(qǐng)參考電轉(zhuǎn)儀推薦步驟來操作），將店擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，店擊完成快速插入冰中。

5)        加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3h。

6)        6,000rpm離心1min，吸掉600ul上清，之后用槍輕輕吹打重懸菌體。之后加到含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，用無菌玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，28℃培養(yǎng)2-3天。【注意：當(dāng)平板只含轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；當(dāng)平板中加入雙元載體抗生素的同時(shí)，再加入20μg/ml 利fu平時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；若使用的平板含50μg/ml 利fu平，需在28℃培養(yǎng)72-90h?！?/span>

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附表1 固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2 固體和液體YEB培養(yǎng)基配方

附表3常見農(nóng)桿菌對(duì)抗生素敏感性總表

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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