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磺胺十五合一檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織、血清、蜂蜜、牛奶、雞蛋、飼料等樣本中的磺胺類(lèi)藥物（Sulfonamides，SAs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的磺胺類(lèi)藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺類(lèi)藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類(lèi)藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類(lèi)藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

組織（高檢測(cè)限方法）……………………0.5ppb

組織（低檢測(cè)限方法）……………………5ppb

血清、尿液、雞蛋………………………2ppb

蜂蜜………………………………………0.5ppb

牛奶………………………………………10ppb

飼料………………………………………20ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

 2.5 樣本回收率：

組織、蜂蜜、雞蛋………………………………85±25%

尿樣、牛奶、血清、飼料………………………80±25%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：1ppm…………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說(shuō)明書(shū)………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCl、NaH2PO4·2H2O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.2M  磷酸鹽緩沖液

    稱取25.8g Na2HPO4·12H2O和4.4g NaH2PO4·2H2O加去離子水500ml溶解。

配液2:乙腈-乙酸乙酯溶液

    量取50ml乙腈和50ml乙酸乙酯加入100ml玻璃瓶中，混勻。

配液3：0.5M鹽酸溶液

    4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。

配液4：0.2M  NaOH溶液

    0.8gNaOH用去離子水100ml溶解

配液5：復(fù)溶液

    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋?zhuān)糜跇颖镜膹?fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織樣本（高檢測(cè)限）處理方法

1）稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)樣本成糊狀，加入7ml乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心5min；

2）移取4ml上層清澈有機(jī)相至干燥容器中，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

3）加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入樣本復(fù)溶液1ml。振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；

4）去除上層正己烷，取50µl下層水相用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.5ppb

5.3.2 組織樣本（低檢測(cè)限）處理方法

1）稱1.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入9ml 0.2M PB緩沖液，震蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min； 

2）取50µl上層液體用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 10    檢測(cè)下限： 5ppb  

5.3.3 雞蛋樣本處理方法

1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；

2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min以上離心5min；

3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)1min，室溫4000r/min以上離心5min；

5）去上層有機(jī)相，取下層水相50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測(cè)下限：2ppb  

5.3.4 血清樣本處理方法 

1）將血樣本于室溫放置30min，室溫4000r/min以上離心10min，分離出血清或過(guò)濾血清；

2）取1ml血清，加入3ml 0.2M PB緩沖液混合，混合30s；

3）取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測(cè)下限：2ppb　　

5.3.5 蜂蜜樣本處理方法

1）稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min；

2）加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心5min；

3）取2ml上層液體于50℃下氮?dú)獯蹈?，?.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；

4）取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.5ppb

5.3.6 尿樣本處理方法

1）用3ml 0.2M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s； 

2）取50µl液體用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測(cè)下限：2ppb 

5.3.7 牛奶樣本處理方法

1）取100ul牛奶樣本用0.2M PB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋?zhuān)?00ul牛奶+1.9ml 0.2M PB緩沖液），混合30s；

2）取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：10ppb     

5.3.8 飼料樣本處理方法

1）稱取2.0±0.05g飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；

2）移取1ml上層有機(jī)相至10ml潔凈干燥玻璃試管中，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

3）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)30s混勻，轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中，室溫4000r/min以上離心5min；

4）除去上層有機(jī)相，移取100ul下層水相至2ml離心管中，加入 900ul 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)1min，混勻；

5）取50ul用于分析。

   樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測(cè)下限：20ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即