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YIJI細(xì)胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到CAMKII磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型*腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中CAMKII活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中CAMKII激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases；CAMK；EC2.7.11.17）屬于*/*激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一，主要由Ca2+/鈣調(diào)素復(fù)合物調(diào)控，在細(xì)胞分裂和分化、神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)分泌、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、糖原代謝、肌肉收縮、記憶、心功能等方面發(fā)揮作用。在大多數(shù)組織中表達(dá)，尤其在神經(jīng)組織中高度表達(dá)。功能分類為特異型，其代表為肌凝蛋白輕鏈蛋白激酶（myosin light chain kinase；MLCK）和多功能型，其代表為Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II；CAMKII）。亞型分類為I型、II型、和IV型。亞體分類為α、β、γ、δ四種。Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶有3個結(jié)構(gòu)域：N端催化域（catalytic）、*調(diào)節(jié)域（regulatory，包含自發(fā)抑制域——autoinhibitory domain；AID和Ca2+/鈣調(diào)素結(jié)合中心），和C端協(xié)同域（association），Ca2+/鈣調(diào)素復(fù)合物激活CAMK后，產(chǎn)生自發(fā)性自我磷酸化。Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬時變化，誘導(dǎo)長時程增強(qiáng)（potentiation）、突觸可塑性（synaptic plasticity）、神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)合成和釋放、與記憶和學(xué)習(xí)功能相關(guān)。其磷酸化目標(biāo)序列為KKALRRQETVDAL。基于底物KKALRRQETVDAL，在ATP的存在下，受到Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型*腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型*腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）   微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

CAMKII激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

• 待測樣品準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 107細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用*消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 測定準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 背景對照測定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置10分鐘
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘
• 樣品測定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置10分鐘
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘
• 計算樣品活性
• 酶標(biāo)儀測定
• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 在30℃溫度下孵育10分鐘
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

七、抑制劑篩選

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計算：

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YIJI30030.1） 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用CAMKII抑制劑（KN-93；IC50=370納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型*腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感