森貝伽酵母DNA微量制備40ml與5ml各如何制備
一. 酵母DNA微量制備(40ml)
  1. 在125ml三角瓶中用40ml YPD培養(yǎng)液在30℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)zui大生長量(過夜)。
  2.將上述培養(yǎng)物移入螺蓋離心管，用*或Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。
  3.將細(xì)胞懸浮在3ml的0.9mol/L*-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)溶液中。
  4. 加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T，置37℃條件保溫1小時。
  5. 用*或Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。
  6. 將細(xì)胞重新懸浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸鈉溶液中。
  7.加0.5ml的10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混勻。
  8. 置65℃保溫30分鐘。
  9.加1.5ml的5mol/L*溶液，在冰浴上放置1小時。
  10. 用Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心10分鐘。
  11.將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的塑料離心管中，室溫下加入兩倍體積的95％乙醇，混勻，以5000～6000r/min離心15分鐘。
  12. 棄上清液，將沉淀物干燥，然后懸浮在3ml TE緩沖液(pH7.4)中，此操作可能需要幾個小時。
  13.用Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新試管，棄沉淀物。
  14.加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液，在37℃下保溫30分鐘。
  15.加入一倍體積的100％異丙醇，輕輕混勻，取出呈松散纖維狀的沉淀物，無需離心，讓其自然干燥。
   16.將沉淀物懸浮在0.5ml TE緩沖液(pH7.4)中，置4℃保存。酵母DNA的zui終濃度約為200μg/ml。如果zui后的溶液混濁不清，用異丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心15分鐘。
二. 酵母DNA微量制備(5ml)
   1. 按酵母于5ml YPD中，置30℃培養(yǎng)過夜。
   2.用*以2000r/min離心5分鐘沉淀細(xì)胞，棄上清液。
   3. 將細(xì)胞懸浮在0.5ml的1mol/L*-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)緩沖液中，轉(zhuǎn)動一支1.5ml離心管中。
   4. 加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37℃保溫1小時。
   5. 離心1小時。
   6.棄上清液，把細(xì)胞懸浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2EDTA溶液。
   7. 加0.05ml的10％ SDS，混勻。
   8. 置65℃保溫混合物30分鐘。
   9.加0.2ml的5mol/L*，把離心管在冰浴中放置1小時。
   10. 離心5分鐘。
   11. 將上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈微型離心管，室溫下加入等體積的無水異丙醇，混勻，放置5分鐘。短暫離心(10秒鐘)棄上清液，讓沉淀自然干燥。
   12. 用0.3ml TE緩沖液(pH7.4)重新懸浮沉淀。
   13. 加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保溫30分鐘。
   14. 加0.03ml的3mol/L醋酸鈉，混勻，用0.2ml的無水異丙醇沉淀，再短暫離心收集DNA。
   15. 棄上清液，自然干燥，用0.1～0.3ml TE緩沖液(pH7.4)重新懸浮DNA。
   16.在使用限制性內(nèi)切酶酶解DNA之前，有必要將zui終濃度溶液離心較長時間(15分鐘)以便除去可能抑制酶解的不溶性物質(zhì)。