http://szhxt8.com.cn/st99968實(shí)驗(yàn)材料:小鼠
實(shí)驗(yàn)原理:細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death，PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰*（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或*（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
主要試劑:1. Annexin V-FITC（膜聯(lián)蛋白-V-FITC） 500μl/250μl 20μg/ml
2. 標(biāo)記緩沖液（Binding Buffer）40/20 ml
3. PBS（1×） 60/30 ml
主要設(shè)備:1. 20μl，200μl，and 1000μl 移液器和吸頭
2. 微量離心管
3. 可調(diào)速離心機(jī)
4. 載玻片（用于熒光顯微鏡觀察）
5. 蓋玻片（用于熒光顯微鏡觀察）
6. 去離子水
7. 冰塊
8. 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟:1. 凋亡細(xì)胞的制備：小鼠腹腔注射*25mg/kg體重，10h后解剖取胸腺，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為2 ×106/ml，備用。
2. 200μl細(xì)胞懸液加入1ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000rpm 4℃離心10min。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細(xì)胞重懸于200μl 標(biāo)記緩沖液。
5. 加入10μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘或4℃反應(yīng)30分鐘。
6. 加入300μl標(biāo)記緩沖液，立即上機(jī)（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)。
注意事項(xiàng):1. 整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。