肌酸(Creatine)含量試劑盒(肌酸酶法)微板法
肌酸(Creatine)含量試劑盒(肌酸酶法)微板法
本試劑盒僅供科研使用 1 肌酸含量(酶法)檢測(cè)試劑盒說明書 (貨號(hào):WS3021W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡介: 肌酸是一種內(nèi)源性化合物,其功能是通過肌酸激酶的磷酸化使機(jī)體維持高的ATP/ADP 比率。肌酸補(bǔ)充劑是一種運(yùn)動(dòng)性能增強(qiáng)劑,亦用于治療肌肉和神經(jīng)退行性等疾病。因此 肌酸的檢測(cè)在研究和開發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用。 本試劑盒利用肌酸酶特異作用于肌酸生成肌氨酸,肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生 成過氧化氫,過氧化氫與顯色劑反應(yīng)呈現(xiàn)(粉)紅色,該有色物質(zhì)在520nm有吸收 峰,進(jìn)而計(jì)算得到肌酸含量。 二、試劑盒組分與配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 11mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使液體落入底部, 再加 1.1mL 的蒸餾水溶解備用。 試劑四 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使液體落入底部, 再加 1.1mL 的蒸餾水溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)管 液體 1mL×1 支 4℃保存 臨用前用蒸餾水稀釋2倍, 即0.5mg/mL肌酸溶液 三、所需儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、離心機(jī)、蒸餾水。 四、肌酸含量檢測(cè): 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、 樣本制備: ① 組織樣本: 取約 0.1g 組織樣本,加 1mL 的提取液研磨,粗提液全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中,12000rpm, 常溫離心 10min,上清液待測(cè)。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣品:澄清的液體可直接檢測(cè);若渾濁則離心后取上清液檢測(cè)。本試劑盒僅供科研使用 2 2、上機(jī)檢測(cè): ①酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,設(shè)置溫度在 37℃,設(shè)定波長到 520nm。 ②做實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本,找出適合本次檢測(cè)樣本的稀釋倍數(shù) D。 ③所有試劑解凍至室溫,在 96 孔板中依次加入: 試劑名稱(μL) 測(cè)定管 空白管 (僅做一次) 標(biāo)準(zhǔn)管 (僅做一次) 樣本 10 蒸餾水 10 標(biāo)準(zhǔn)品 10 試劑一 100 100 100 試劑二 70 70 70 試劑三 10 10 10 混勻,37℃避光孵育 10min, 試劑四 10 10 10 混勻,37℃避光反應(yīng) 30min,520nm 處讀取吸光值 A(直到 A 值不變), △A=A 測(cè)定-A 空白。 【注】:1. 測(cè)定管的 A 值若超過 1,可用蒸餾水對(duì)樣本進(jìn)行稀釋,稀釋倍數(shù) D 代入計(jì)算公式。 2. 若△A 的值小于 0.005,可增加樣本加樣體積 V1(如由 10μL 增至 50μL,則試劑一相應(yīng) 減少),或增加樣本取樣質(zhì)量 W;則改變后的 V1 和 W 需代入公式重新計(jì)算。 3. 若樣本自身含有高的肌氨酸含量,需增設(shè)一個(gè)樣本自身對(duì)照: (即 10μL 樣本+110μL 試劑一+70μL 試劑二+10μL 試劑三),△A=A 測(cè)定-A 對(duì)照。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、按照質(zhì)量計(jì)算: 肌酸含量(μmol/g)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×△A÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷(V1÷V×W)×D×103÷Mr =3.81×△A÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)×D÷W 2、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算: 肌酸含量(nmol/104 cell)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×△A÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷(V1÷V×500)×D×106÷Mr =7.63×△A÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)×D 3、按照體積計(jì)算: 肌酸含量(μmol/L)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×△A÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷V1×D×106÷Mr =3813×△A÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)×D C 標(biāo)準(zhǔn)---標(biāo)品濃度,0.5mg/mL; Mr---標(biāo)準(zhǔn)品分子量,131.13; V---提取液體積,1mL; V1---加入樣本體積,0.01mL; 500---細(xì)胞數(shù)量,百萬; D---稀釋倍數(shù),未稀釋即為 1。