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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬流感病毒H1N2亞型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒（雙色實(shí)時(shí)熒光PCR法）

英文名稱：Swine Influenza Virus H1N2 Detection Kit (Dual channels Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測(cè)豬流感病毒，對(duì)豬流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)豬流感病毒H1N2基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含豬流感基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為豬基因組DNA，陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的豬流感病毒H1N2亞型cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

如使用原始標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)本應(yīng)新鮮采集并使用滅菌生理鹽水懸浮原始標(biāo)本。

應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃，避免反復(fù)凍融，長(zhǎng)期保存不會(huì)影響本試劑盒檢測(cè)結(jié)果，但有可能影響培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

根據(jù)需要，在上述準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照品以及陽(yáng)性對(duì)照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個(gè)檢測(cè)過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無(wú)核酶處理。

3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。