蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase）

 描述：

蔗糖磷酸化酶屬于糖基水解酶 13 家族，是一種催化轉移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖。該酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖為供體，多類物質如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷 。 該 蔗糖磷酸化酶 （ SucrosePhosphorylase ） 通 過 重 組 制 備 而 得 ， 其 催 化 蔗 糖（ sucrose ） 的 磷 酸 化 反 應 ， 生 成 D-fructose 和α-D-glucose-1-phosphate，反應式為：
Sucrose+Pi=α-D-glucose-1-phosphate+D-fructose。該酶的比活>100U/mg，該酶通過改造可耐熱，反應溫度可在 30~65℃進行，反應溫度為 55℃。在 60℃孵育 60h 后活性損失<30%。
活性定義：1 單位指在 37°C，pH 7.6 條件下，每分鐘由蔗糖催化生成 1.0 μmole 的 D-fructose 所需的酶量。反應緩沖液為 100mM KH2PO4，200mM Sucrose，pH7.6。
保存：-20℃長期保存。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。