T4 UvsX Recombinase

描述:

UvsX 重組酶，來(lái)源于 T4 噬菌體，是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無(wú)誤修復(fù)和復(fù)制叉重新啟動(dòng)的過(guò)程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列，以進(jìn)一步完成鏈置換。經(jīng)檢測(cè)，該酶無(wú)核酸酶活性。
儲(chǔ)存：

置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 長(zhǎng)期保存，短期使用置于 4°C，保存一個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
熱失活：60°C，10min。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反應(yīng)緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 擴(kuò)增試驗(yàn)。該試劑 4°C
條件下放置 1 個(gè)月性能無(wú)下降。
基于本蛋白進(jìn)行 RPA 反應(yīng)測(cè)試的全套試劑
用于 RPA 擴(kuò)增的測(cè)試引物與探針
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上機(jī)反應(yīng)前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（終濃度 14 mM），總反應(yīng)體積 25 μl?；旌暇鶆颍㈦x心，置于 39-42℃條件下反應(yīng) 30min。
2. 進(jìn)行熒光 RPA 擴(kuò)增在進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)體系中，額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的終濃度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的終濃度），即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。本方法應(yīng)用原理為 ExoIII 切割 THF 位點(diǎn)，使熒光與猝滅基團(tuán)分離，報(bào)告熒光信號(hào)。
特別說(shuō)明：
（1） 以上 RPA 擴(kuò)增測(cè)試屬于蛋白功能性測(cè)試，按照以上實(shí)驗(yàn)操作流程，可獲得 RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)一步的優(yōu)化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反應(yīng) Buffer，甚至加樣順序，均可能進(jìn)一步提高 RPA 的擴(kuò)增性能。
（2）關(guān)于 DNA 聚合酶的選擇， 測(cè)試了三種常見(jiàn)的 DNA聚合酶，在進(jìn)行熒光法測(cè)定時(shí)，推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃條件下，總能獲得快的擴(kuò)增速度，且熒光信號(hào)更強(qiáng)。在 Basic 擴(kuò)增中 Sau 表現(xiàn)出特異性擴(kuò)增能力更佳。
（3）關(guān)于 RPA 的靈敏度與非特異擴(kuò)增，在 Basic 試劑的擴(kuò)增中，仍然存在非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，這需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)組分及引物序列。在使用熒光探針?lè)〞r(shí)，但由于特異性探針的存在，非特異擴(kuò)增產(chǎn)物通常無(wú)熒光信號(hào)值，但此時(shí)會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會(huì)顯著降低非特異性擴(kuò)增，但會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增速度減緩，此時(shí)需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量，以維持 RPA 的擴(kuò)增速度。
（4）據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在進(jìn)行試紙條 RPA 實(shí)驗(yàn)時(shí)，傾向使用 Nfo 內(nèi)切酶又名 Endonuclease IV， 來(lái)對(duì)擴(kuò)增探針進(jìn)行切割，但  未予測(cè)試，目前無(wú)法提供相應(yīng)參數(shù)。
（5）RPA 反應(yīng) Buffer 對(duì)擴(kuò)增至關(guān)重要，輕微的濃度差異，均可導(dǎo)致擴(kuò)增效率大幅下降，甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑，使用時(shí)務(wù)必保證加樣準(zhǔn)確，Tip 頭中的殘液務(wù)必打入 EP 管中。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。