Super ECL Substrate

超敏 ECL 顯色液用于 Western、Northern 和 Southernblot 分子雜交的化學發(fā)光檢測，比傳統(tǒng)化學顯色法靈敏度高，可達 pg 水平。原理是采用新型發(fā)光底物（Luminol），其與辣根過氧化物酶反應時產(chǎn)生很強的發(fā)光信號，在暗室中對X-光片感光，以此檢測微量蛋白而獲得理想的實驗結果。海基增強型 ECL 顯色液具有靈敏度高，持續(xù)時間長等特點。
應用
在 Western 印跡分析，核酸雜交以及 EMSA 實驗中，HRP標記的二抗或探針與靶分子結合再與底物反應產(chǎn)生可見光。
儲存：2-8°C，Super ECL A 要求避光保存。
操作方法（以 Western Blot 為例)
1．按每平方厘米膜面積用 0.1-0.2 ml 配置顯色液：根據(jù)顯色液的需要量，取等體積 A 液和 B 液，混勻后避光保存?zhèn)溆茫辉擄@色液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
2．2. 取出膜，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質面）朝上，在膜的中央加適量的配置好的顯色液（6×8 cm 的膜加 2 ml 顯色液），溶液向四周迅速擴散，覆蓋所有膜面。室溫保溫 5 分鐘左右，在此過程中請仔細觀察信號的出現(xiàn)。注意：如果信號強，在暗室中能很快看到陽性信號出現(xiàn)。
3．3. 待信號出現(xiàn)且穩(wěn)定后，用鑷子夾起膜，除去多余的顯色液，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質面）朝上，在轉移膜的上面再覆蓋一層保鮮膜，除去保鮮膜與轉移膜之間的空氣泡，請務必保證保鮮膜是干凈的，不被其他雜物或液體污染。
4．4. 在暗室中，將膜的正面對著 X-光片，放入暗盒。次曝光時間在 1 分鐘左右(有經(jīng)驗的操作者可以根據(jù)信號的強弱自行決定)，立即按要求對 X-光片進行顯影和定影，確定曝光時間。曝光時間從數(shù)秒到數(shù)小時不等；特別弱的過夜曝光也可。
注意
1.PVDF 膜較硝酸纖維膜能更好的結合蛋白，因此呈現(xiàn)較強的信號。選高質量的 PVDF 膜；盡可能不用 Nylon 膜。
2.2.與抗體結合以后，要保證膜處于濕潤狀態(tài)，否則會導致背景較高。
3.3.沒有信號的原因：有些抗體不識別變性抗原，有時需要考慮電泳過程對蛋白質結構的影響；樣品中無待測蛋白質或含量過低；一抗效價低，用量少，可適當增加一抗的用量；
4.4.背景過高原因：轉移膜封閉不充分；與抗體孵育后洗滌；膜在處理過程中過干；二抗用量過多等。
5.5.注意及時更換顯影液、定影液。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。