Western一抗二抗通用稀釋液

生產(chǎn)的 Western 一抗二抗通用稀釋液用于做 Western blot 實(shí)驗(yàn)時(shí)一抗或者二抗的稀釋。用本稀釋液稀釋的一抗或者二抗使用后，可放在 4℃或者-20℃保存，并且可以反復(fù)多次使用，節(jié)約您寶貴的抗體。按照每個(gè)一抗稀釋10ml 計(jì)算，該 Western 一抗稀釋液可以稀釋 10 個(gè)或 10 次Western Blot 雜交實(shí)驗(yàn)。該制品中不含有抑制熒光顯色或HRP 顯色的成分。應(yīng)用：Western blot 實(shí)驗(yàn)時(shí)一抗或者二抗的稀釋
儲(chǔ)存：-20℃ 可保存 3 年。開(kāi)始使用后請(qǐng)于 4℃保存，有效期為 1 年。
使用方法：
1. 進(jìn)行一抗孵育雜交參考所用的一抗說(shuō)明書(shū)，以及樣品中目的蛋白的含量，使用本抗體稀釋液按照適當(dāng)比例稀釋一抗，如 1:1000、1:500 等，一抗稀釋后即可直接用于 Western blot 實(shí)驗(yàn)（室溫孵育雜交1h 或 4℃雜交過(guò)夜）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，可以回收稀釋的一抗，4℃或-20℃ 保存，以用于下次的 Western blot 實(shí)驗(yàn)。
2. 進(jìn)行二抗孵育雜交進(jìn)行完一抗孵育后，TSBT 溶液洗滌膜 1~2 次，同樣參考二抗說(shuō)明書(shū)，使用本抗體稀釋液，進(jìn)行二抗的稀釋，并進(jìn)行二抗的孵育雜交（通常二抗雜交時(shí)間為室溫 30min 即可）。雜交完畢后 TBST 洗滌膜 3~4 次，并進(jìn)行下游顯色。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。