測(cè)序后純化試劑盒 ( 磁珠法）

運(yùn)輸保存：常溫運(yùn)輸，建議4℃保存。

PCR 后磁珠純化方法及步驟 ：

1.96孔反應(yīng)板從PCR儀下機(jī)后，放入黑色的96孔板架上，配平，在5810R離心機(jī)，使用水平轉(zhuǎn)頭， 4000轉(zhuǎn)/分（4000rpm）離心一分鐘。

2.從4℃冰箱中取出磁珠工作液，手動(dòng)或振蕩器充分震蕩磁珠液，使其重新懸浮， 每孔加入磁珠液 5-10ul（建議使用5ul），再加入 70%乙醇 50ul，蓋上膠墊，混勻后震蕩5分鐘。

3. 將96孔反應(yīng)板放入96孔磁力板上放置3分鐘，使磁珠吸附在孔底處或至溶液變清亮。

4. 帶磁力板棄上清（切記：樣品板不要離開磁方板），去掉膠墊，墊上吸水紙，在5810R離心機(jī)上倒離心60 秒（300 轉(zhuǎn)/分）。

5. 每孔加入 70%酒精50ul，蓋上膠墊，重新震蕩懸浮，放入96孔磁力板上放置3分鐘，使磁珠吸附在孔底處或至溶液變清亮。

6.帶磁力板棄上清（切記：樣品板不要離開磁方板），去掉膠墊，墊上吸水紙，在5810R離心機(jī)上倒離心60 秒（300 轉(zhuǎn)/分）。

7.重復(fù)5、6步一次。

8.每孔加入30ul 的滅菌后的超純水，蓋上膠墊，震蕩使磁珠重新懸浮。

9.在5810R離心機(jī)上正離心 10秒（300 轉(zhuǎn)/分）將側(cè)壁水珠離下即可。

10.將96孔反應(yīng)板從磁力架上取下來(lái)，轉(zhuǎn)移到測(cè)序儀跑板專用磁力架上，更換膠墊并扣緊。

11.上機(jī)跑板（切記：上在帶有磁鐵的底座上，以免損壞毛細(xì)管）。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。