細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選

2012年06月13日 17:13:09人氣：1865來(lái)源：上海都宜生物科技有限公司

細(xì)胞 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選

1．確定抗生素作用的*濃度：不同的 細(xì)胞 株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn)，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的zui低作用濃度。

① 提前 24 小時(shí)在 96 孔板或 24 孔板中接種細(xì)胞 8 孔，接種量以第二天長(zhǎng)成 25%單層為宜，置 CO2 孵箱中 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

② 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml）。

③ 培養(yǎng) 10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為 400-800μg/ml，篩選穩(wěn) 定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別維持時(shí)使用篩選濃度的一半。

2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。

3．轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)后按 1: 10 的比例將轉(zhuǎn)染 細(xì)胞 在 6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個(gè) 細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。

① 濾紙片法：用消毒的 5x5mm 濾紙片浸過(guò)*，將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上 10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于 24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在 24 孔板中長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入 25cm2 培養(yǎng)瓶中，長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)入 75cm2 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

② 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來(lái)后做連續(xù)的 10 倍稀釋（10-2-10-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到 96 孔板中培養(yǎng)，7- 10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆。

4. ELISA或 Westernblot檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量zui高的克隆傳代并保種。

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